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【资料图】

《抑制血管内皮生长因子-B信号通过靶向白色脂肪组织中的脂肪分解来预防非酒精性脂肪性肝病的发展》

通讯作者Ulf Eriksson，来自瑞典-斯德哥尔摩-卡罗林斯卡医学院-医学生物化学与生物物理系-血管生物学研究室。

背景与目的 ：肝脏脂肪变性是 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD) 的一个特征，NAFLD是 2型糖尿病(T2DM) 的常见并发症。NAFLD的发病机制复杂，涉及肝脏和 白色脂肪组织(WAT) 之间的串扰。 血管内皮生长因子B(VEGF-B) 通过调节血管系统的运输特性来控制组织中的脂质堆积。目前尚不清楚血管内皮生长因子-B信号转导途径在T2DM肝脏脂肪变性和NAFLD中的作用。

方法 ：用抗血管内皮生长因子-B中和抗体处理C57BL/6J小鼠或脂肪细胞特异性高表达或低表达的小鼠(AdipoqCre+/VEGF-BTG/+小鼠和AdipoqCre+/Vegfbfl/+小鼠)，6个月的 高脂饮食(HFD) 或饲料喂养，然后评估NAFLD的发展。分析肥胖症和NAFLD患者(NAFLD患者24例，非NAFLD患者24例)WAT活检组织中VEGF-B的表达，并与临床病理特征进行相关性分析。

结果 ：药物抑制糖尿病小鼠的血管内皮生长因子-B信号转导，通过阻断脂肪分解，减轻肝脏脂肪变性和非酒精性脂肪肝。通过使用HFD喂养的AdipoqCre+/VEGF-BTG/+小鼠和HFD喂养的AdipoqCre+/Vegfbfl/+小鼠，我们从机制上证明了对VEGF-B信号的抑制以脂肪细胞中的脂解为靶点。减少血管内皮生长因子-B信号通过减少WAT炎症、缓解WAT胰岛素抵抗和降低激素敏感脂肪酶的活性来改善NAFLD。对NAFLD患者的人类WAT活检组织的分析提供了证据，支持血管内皮生长因子-B信号在NAFLD发生中的作用。

来自两个WAT仓库的脂肪细胞中VEGF-B的表达水平与人类功能障碍的WAT和NAFLD的发展相关。

结论 ： 综上所述，我们来自小鼠模型和人类的数据表明，血管内皮生长因子-B拮抗剂可能是一种通过抑制脂解来靶向肝脏脂肪变性来对抗非酒精性脂肪肝的方法 。

背景

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是最常见的慢性肝病，也是2型糖尿病(T2DM)的共病。 在T2DM患者中，胰岛素抵抗与肝脏脂肪变性和NAFLD的发生有关。

NAFLD进展 为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的机制是复杂的， 依赖于白色脂肪组织(WAT)和肝脏之间的串扰 。

WAT中胰岛素抵抗的发展削弱了胰岛素的抗脂作用，导致更多的 游离脂肪酸(FFAs) 被释放到血液中。

肝脏对FFAs的摄取随着FFAs水平的上升而增加，这与肝脏的胰岛素抵抗、新生脂肪生成(Dnl)和糖异生作用一起，导致有毒脂质在肝脏中积累，导致线粒体功能障碍和内质网应激。

肝脏脂肪毒性诱导慢性炎症，激活肝星状细胞，导致进行性纤维化、硬化和肝功能障碍。

我们发现血管内皮生长因子B(VEGFB)是一种内皮FFA转运的调节因子，它控制内皮脂肪酸转运蛋白的表达，从而控制组织脂质的积累。

降低糖尿病模型中的VEGFB水平，减少心脏、骨骼肌和肾脏的脂质堆积，防止胰岛素抵抗、T2DM和糖尿病肾脏疾病的发生。

VEGFB属于VEGF家族，其配体VEGFA，VEGFB和PIGF部分重叠受体结合特异性。

血管内皮生长因子-B与血管内皮上的血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)和神经亲和素1(Nrp1)结合。

全身性抑制VEGFR1和Nrp1信号可改善糖尿病小鼠的肝脏脂肪变性 。

然而，通过抑制VEGFR1-Nrp1信号通路来针对哪些血管内皮生长因子配体和细胞类型尚不清楚。

VEGFR1和Nrp1的联合内皮缺失通过激活VEGF介导的VEGF受体2(VEGFR2)信号来保护HFD喂养的小鼠免受肝脏脂肪变性的影响，从而减少空肠对脂质的吸收。

然而，在另一项研究中，单独内皮缺失VEGFR1，或联合腺病毒载体VEGFB给HFD喂养的小鼠，通过通过VEGF/VEGFR2信号增加Wat血管形成和褐化来防止肝脏脂肪变性的发生。

在这里，我们通过使用脂肪细胞中 VEGF-B信号增加或减少 的糖尿病小鼠，以及 中和抗VEGF-B抗体 ，探讨WAT中的VEGF-B信号如何参与NAFLD 。

我们还使用来自NAFLD患者的 临床WAT活检 以及 匹配的转录组数据 和 临床记录 来探讨人类 WAT中的VEGF-B信号 是否在NAFLD的发生发展中起作用 。

材料和方法

动物实验

动物得到人道关怀，实验方案按照瑞典斯德哥尔摩动物福利委员会批准的方案执行(10627/18年)。

小鼠可以自由获取水，并自由喂养标准饲料或高脂饲料(60kcal%脂肪，D12492，Research Diets，美国)。

为了治疗干预，从Jackson实验室(C57BL/6J)获得的雄性小鼠被注射抗血管内皮生长因子-B抗体(Ab)(n=10)(澳大利亚帕克维尔CSL有限公司专利)或同型匹配的对照抗体(n=10)。

动物均经腹膜腔注射(200lg/只，每周2次)。饲喂HFD 2个月后开始治疗，用HFD饲养动物6个月。

由德国科隆Taconic Artemis公司建立高表达(VEGFBTG/+)或低表达(Vegfbfl/+)转基因小鼠模型，并与从Jackson实验室获得的脂肪细胞特异性Cre表达基因(AdipoqCre+)小鼠(AdipoqCre+/VEGFbfl/+小鼠)杂交，以产生脂肪细胞特异性高表达的小鼠(AdipoqCre+/VEGFBTG/+小鼠)或脂肪细胞特异性低表达的小鼠(AdipoqCre+/Vegfbfl/+小鼠)，并对每种小鼠进行相应的对照基因分型。

以WT/WT、WT/AdipoqCre+和WT/Vegfbfl/+为对照，WT/WT、WT/AdipoqCre+和WT/VEGF-BTG/+为对照。

转基因小鼠分别饲喂标准饲料(AdipoqCre/+/VEGFBTG/+n=7，AdipoqCre+/Vegfbfl/+n=8，对照组13只，对照组14只)或高脂饲料6个月(AdipoqCre/+/VEGFBTG/+n=10，AdipoqCre+/Vegfbfl/+n=10，对照组15只，对照组16只)。

为了研究VEGF-B的整体缺失，如上所述产生和培育了雄性Vegfb-/-(C57BL/6 J)(n=12)和产仔对照小鼠(Vegfb+/+)(n=8)。为了研究WT小鼠(n=6)，雄性小鼠(C57BL6/J)来自Jackson实验室

NAFLD患者的临床WAT活检

人类内脏白色脂肪组织(VAT)和皮下白色脂肪组织(SAT)是从接受减肥手术的现有临床队列中获得的。

该研究包括48名肥胖女性，不论有无NAFLD，她们的年龄、BMI和2型糖尿病状态都是匹配的分析人类活检组织的SAT和VAT基因表达，并提取Osorio-Conles等人的临床记录。

临床记录包括肝损伤的血浆生物标志物的测量，NAFLD被定义为超声检查肝脂肪变性的存在。

所有参与者提供书面知情同意，并从巴塞罗那医院临床研究伦理委员会获得符合《赫尔辛基宣言》的伦理委员会批准。

统计分析

对于小鼠数据集的分析，分别使用Shapiro-Wilk或Kolmogorov-Smirnov正态检验、具有Welch校正的不配对学生t检验、单向ANOVA或Brown-Forsythe以及分别具有Tukey‘s或Dunnett的Welch ANOVA。采用随机后多重比较检验方法。

对于人体数据集的分析，使用了Shapiro-Wilk或Kolmogorov-Smirnov正态检验和具有Spearman相关性的简单线性回归分析。

如果人类数据集未通过正态检验，则对数据集进行log2转换，并使用具有皮尔逊相关性的简单线性回归分析。

所有统计分析使用GraphPad Prism 9.3.1进行，p值<0.05被认为是显著的。有关所用资料和统计分析的进一步详情，请参阅补充资料。

结果

全身性抑制血管内皮生长因子-B信号转导靶向肝脏脂肪变性和改善非酒精性脂肪肝。

为了探讨血管内皮生长因子-B信号在NAFLD中的作用，我们分析了中和抗血管内皮生长因子-B抗体或同型匹配对照抗体在高脂饮食和饮食喂养的小鼠中的作用(图S1A、B)。抗血管内皮生长因子-B抗体治疗不改变高脂饲料喂养的小鼠的体重或肝脏重量。

在NAFLD中，脂质以三酰甘油(TAG)的形式储存在脂滴(LDS)中，可以通过由Plin2a基因编码的脂联素的表达来衡量。

抑制VEGF-B信号转导减少了高脂饲料和饲料喂养小鼠肝脏LDS的积聚和Plin2a的表达(图1A-C和图S1E，F)。

采用超快速液相色谱-质谱仪(UFLC-MS)对高脂饲料喂养的抗血管内皮细胞生长因子-B抗体处理小鼠的肝脏进行了脂质组学分析。

UFLC-MS分析证实，抑制血管内皮生长因子-B信号可改善肝脏TAG含量(图1D)。

为了评估抗血管内皮生长因子-B抗体治疗是否针对特定的标签子集，采用OPLS-DA(正交投影到潜在结构判别分析)建模(图2)。S1G，H)。

OPLS-DA表明，通过对长的和高度不饱和的标签(HUTAGs)的分析，实现了试验组之间的最大分离。

计算了HUTAGs与其余标签的比率(HUTAG/Tag*)，结果显示，喂食高脂饮食且VEGF-B活性降低的小鼠显示HUTAG/Tag*降低，这表明VEGF-B针对HUTAGs的丰度(图1E)。

（ 图1：全身性抑制血管内皮生长因子-B信号作用于肝脏脂肪变性并改善非酒精性脂肪肝 。用抗血管内皮生长因子-B抗体和对照抗体处理高脂饲料喂养的小鼠和饲喂WT小鼠的分析。(A)图像和(B)脂联素表达的量化。(C)Plin2a表达。UFLC-MS随后定量(D)标记(E)HUTAGs与剩余标记的比率*(F)二酰甘油、(G)神经酰胺、(H)FFAs、(I)SFFAs、(J)图像和(K)F4/80表达的定量。(L)图像和(M)组织学H&E染色评分。(N)图像和(O)MT染色的组织学评分。(P)血浆丙氨酸转氨酶水平。图表中描绘了动物的数量。数据以均值±结构方程(单因素方差，后跟Tukey‘s或Dunnett)表示。S多重比较检验)。小写字母表示事后分析的显着性(p<0.05)，不同字母的组在每次事后比较中具有统计学差异。AB，抗体；ALT，丙氨酸氨基转移酶；FAME，FA甲酯；脂肪酶，脂肪酸(FA)转甲酯；FFAs，游离脂肪酸；HE，苏木精-伊红；HFD，高脂饮食；HUTAGs，高度不饱和标签；MT，Masson。S三色；NAS，非酒精性脂肪性肝病活动评分；SFFAs，饱和游离脂肪酸；TAG，三酰甘油；WT，野生型。）

甘油二酯和神经酰胺有助于肝脏胰岛素抵抗和NAFLD的发展。

我们表明，高脂饲料喂养的抗血管内皮生长因子-B抗体处理的肝脏积累的二酰甘油较少(图1F)。

肝脏胰岛素抵抗的发生伴随着较短酰链长度的神经酰胺的增加和较长酰链长度的神经酰胺的减少。

抗血管内皮生长因子-B抗体处理的肝脏包含较低水平的短链神经酰胺和相同水平的长链神经酰胺(图1G和图S1i)。

有人认为肝脏中游离脂肪酸的蓄积比TAG更有害，而饱和脂肪酸在肝细胞中的蓄积与NAFLD的进展相关。

我们评估了肝脏脂肪酸(FA)转甲酯和FA甲酯，以区分与其他分子结合的FFA和未结合的FFA。

抗血管内皮生长因子-B抗体处理的HFD喂养的小鼠降低了总FA转甲酯含量和饱和FA转甲酯水平(图1H，I)，但没有检测到FA甲酯水平的差异(图1H，S1J)。

在NAFLD中，总的肝脏磷脂含量降低。

与饲料喂养的肝脏相比，对照处理的HFD肝脏含有更低水平的磷脂，这一特征在抗血管内皮生长因子-B抗体处理的HFD喂养的肝脏中正常化(图S1K-N)。

NAFLD以疾病谱系的形式存在，在组织学上被归类。肝脏脂肪变性可导致肝脏炎症和从NAFLD到NASH的进展。

用HFD喂养的对照组小鼠表现出免疫细胞的激活增加，通过F4/80+巨噬细胞的表达和降低高脂饮食小鼠的血管内皮生长因子-B活性可减轻肝脏炎症(图1J，K)。

通过H&E染色和NAFLD活动评分(NAS)的评估来评估肝损伤，正如Kleiner等人使用NAS模板所描述的那样，我们表明HFD本身诱导了几种与NASH相关的病理，这些特征通过抗VEGF-B抗体治疗而减少(图S10和图1L，M)。

对照组喂饲HFD的小鼠的NAS为3.5，这对应于组织学诊断为“临界NASH”，而服用抗血管内皮生长因子-B抗体的HFD喂饲的小鼠的NAS为2.3，对应于“非NASH”(图1L，M)。

使用Kleiner等人开发的纤维化分期系统进行Masson三色肝染色和分级，12例用于评估纤维化。

服用HFD的对照组小鼠的肝纤维化评分为0.7，对应于轻度纤维化，经抗血管内皮生长因子-B抗体治疗后降至0.3(图1N，O)。

NAS>2的特点是存在细胞周围和/或桥接性纤维化，因此HFD本身并不能概括临床NASH的纤维化表型。

对饲喂食物的小鼠肝脏的分析，与抗体治疗方案无关，没有发现任何形态异常(图S1P，Q)。

以血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平衡量的肝损伤在用抗血管内皮生长因子-B抗体处理的高脂饲料喂养的小鼠中减少(图1P)。

全身抑制血管内皮生长因子-B通过靶向脂肪分解和HSL活性改善非酒精性脂肪肝

肝脏和其他组织中的几个细胞过程可以促进肝脏脂肪堆积(图2a)。

为了探索在正常生理条件下，血管内皮生长因子-B如何调节肝脏脂肪变性，我们利用饲喂血管内皮生长因子-B缺乏的小鼠，分析了控制脂肪代谢的肝脏途径(图S2A)。

我们研究了与FFA摄取、DNL和b-氧化相关的基因的表达。

在VEGF-B缺陷的小鼠中，Fatp5和几种造脂酶的表达减少，而控制氧化的酶的表达没有改变(图S2B-E)。

此外，血管内皮生长因子-B不干扰肝脏脂质的输出或摄取(图S2F-H)。

膳食摄入量与肝脏脂肪堆积有关，但缺乏血管内皮生长因子-B并不影响饲料喂养小鼠的摄食量。

抑制血管内皮生长因子-B可能通过减少空肠对脂肪的摄取来靶向肝脏脂肪变性。

然而，VEGFb在小鼠肠道绒毛中的表达较低，并且通过空肠油红分析来评估脂肪堆积，在缺乏VEGF-B的小鼠中没有受到影响(图S2I，J)。

水中的脂肪分解也会影响肝脏的脂肪堆积。体外脂肪分解，评估为从附睾水中释放非酯化脂肪酸(EWAT)，和血浆非酯化脂肪酸水平在两个基因型中相似(图S2K，L)。

在NAFLD中，肝脏中的FFA水平可能是由于DNL增加、饮食摄入和/或WAT内的脂解作用引起的(图2A)。

抗血管内皮生长因子-B抗体在高脂饲料喂养的小鼠中的治疗降低了肝脏中造脂酶的表达(图S2m)。

然而，DNL中的酶的转录调节是温和的，这表明其他机制也参与其中。

此外，在高脂饲料喂养的小鼠中阻断血管内皮生长因子-B并不影响饮食摄入量(图S2N)。

在NAFLD中，Wat脂肪分解的增加可以解释肝脏中脂肪积聚的60%-70%。

喂食HFD的小鼠的脂肪分解增加，这一作用可通过给予HFD的小鼠的抗VEGF-Bab处理来减弱(图2B-C)，而在喂食HfD的小鼠中，使用抗VEGF-B-Ab的治疗没有效果(图S2O，P)。

为了弄清血管内皮生长因子-B信号控制Wat脂解的机制，研究了不同的脂解调节剂。

脂肪分解的荷尔蒙调节剂包括激活剂、胰升糖素和儿茶酚胺，以及失活剂胰岛素。

在高脂饲料喂养的小鼠中，抗血管内皮生长因子-B-抗体治疗降低了HOMA-IR，这表明全身胰岛素抵抗减少了，但没有检测到血糖或胰岛素水平的差异(表1)。

在饮食喂养的小鼠中，抗血管内皮生长因子-Bab治疗不影响代谢参数(表S1)。

WAT的脂解活性还取决于脂肪细胞的胰岛素敏感性。我们评估了脂肪胰岛素抵抗(ADIPO-IR)，正如Gastaldelli等人所描述的，14抗VEGF-B-Ab治疗降低了HFD喂养的小鼠的ADIPO-IR(表1和表S1)。

我们使用正电子发射断层扫描来分析在不同的WAT中，降低WAT胰岛素抵抗是否与增加葡萄糖摄取有关。

体内放射性葡萄糖示踪剂[18]FDG在WAT中的摄取和累积在HFD喂养的抗血管内皮生长因子B-抗体处理的小鼠中增加(图2D，E)。

体外测量eWAT中的放射性证实了用抗血管内皮生长因子-B-抗体处理的HFD喂养的小鼠葡萄糖摄取增加(图2F)。

胰岛素和儿茶酚胺信号控制脂解酶，激素敏感脂肪酶(HSL)，受HSL和脂肪酸结合蛋白4(FABP4)的可逆磷酸化调节，以及ATGL(脂肪甘油三酯脂肪酶)，受转录调节和1-酰甘油-3磷酸O-酰基转移酶控制。

我们用免疫组织化学(IHC)检测eWAT中p-HSL的抗体来检测eWAT中HSL的活性。

饲喂HFD本身增加了PHSL，而在饲喂饲料的小鼠中没有看到影响(图2G，H和S2Q，R)，该PHSL通过抗VEGF-B-Ab处理而降低。

无论是在食物还是在高脂饲料治疗组之间，都没有观察到脂解调节剂的eWAT表达谱变化(图S2S-T)。

为了评估阻断VEGF-B是否影响对脂肪细胞脂解敏感的肝脏通路，我们测量了这些调节因子的表达水平。

肝FGF21的表达是由NAFLD诱导的，FGF21的短期作用是减少Wat脂解，但长期作用尚不清楚，FGF21的增加被认为是一种NAFLD.19的生物标记物HFD增加了FGF21的表达，而抗VEGF-B-Ab处理后FGF21的表达减少(图S2U)。

FGF21的表达增加与过氧化体增殖物激活受体(PPAR)-a共激活蛋白-1α(PGC-1a)依赖的b-氧化上调和DNL19下调有关。

在对照组HFD喂养的小鼠中观察到编码PGC-1a的Ppargc1a基因强烈上调，并被抗VEGF-B-Ab处理逆转(图S2U)。

PPAR-a是肝脏FA氧化的主要调节因子，也被脂解产生的FFA激活。HFD本身的喂养增加了PPAR-a及其下游靶点的表达，尽管在处理组之间没有检测到差异(图S2V)。

此外，与NAFLD、GoS2和Pnpla2相关的脂解调节因子的肝脏表达在治疗组之间没有发现差异(图S2W-X)。

T2DM和NAFLD的脂解激活导致WAT的形态改变。

EWAT的H&E染色显示，经抗VEGF-B-Ab处理的HFD喂养的小鼠脂肪细胞较大，细胞大小呈双峰分布(图2I-K)，但脂肪组织质量没有差异(图S2Y)。

尽管有脂肪细胞肥大的发展，抗血管内皮生长因子-B-抗体治疗减少了脂肪组织巨噬细胞的聚集，评估为冠状结构的数量和几个促炎基因的表达(图2L，M)。在不同的饮食处理组之间，没有检测到脂肪细胞的形态和炎症的差异(图S2Z-AC)。

全身抑制血管内皮生长因子-B通过靶向血管内皮生长因子-B信号通路改善非酒精性脂肪肝

接下来，我们的目标是探索阻断血管内皮生长因子-B是否通过靶向肝脏或肝脏中的血管内皮生长因子-B信号通路来改善WAT脂解和NAFLD。

在喂食食物的小鼠中，与Wat和骨骼肌相比，Vegfb在肝脏中的表达较低(图3A)。在WAT中，Vegfb和VEGF-B受体均高表达(图3A-C)。

对来自WT MICE 21的可用的单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据的分析表明，Vegfb在不同类型的肝细胞中表达水平较低，而在脂肪间充质干细胞中表达水平较高(图S3A-F)。

用单链RNA转录法检测到VEGFR1在肝脏和WAT的内皮细胞(ECs)中表达(图S3A-F)。我们的细胞表达谱和scRNA-seq数据挖掘表明，系统性抑制血管内皮生长因子-B通过靶向WAT中的血管内皮生长因子-B活性来改善NAFLD(图3D)。

通过检测VEGF-B、VEGFR1和Nrp1在eWAT中的细胞表达，探讨其在eWAT中的信号转导途径。

WT小鼠的EWAT被分成内皮细胞、脂肪细胞和基质细胞(图3e)。

通过qPCR分析(图3FH)评估了分离组份中细胞的浓缩情况。

VEGFB在脂肪细胞组分中表达丰富，而VEGFR1和Nrp1在EC组分中表达水平最高(图3I-K)。

用免疫组织化学法结合内皮细胞和脂肪细胞标记物分析WT小鼠EWAT中血管内皮生长因子B、血管内皮生长因子1和Nrp1的表达。

血管内皮生长因子-B的表达最初与脂肪细胞相关，并与细胞质FABP4标记密切相关(图3L)。

VEGFB抗体的特异性在VEGFb-/-小鼠的eWAT中得到了验证。S3G)。

与VEGF-B相反，VEGFR1和Nrp1在内皮细胞中大部分表达(图3M)。我们的分析表明，Vegfb主要在脂肪细胞中表达，提示它向位于内皮细胞上的受体发出旁分泌信号。

（图3.血管内皮生长因子-B信号通路的活性在肝脏中低，在水中高。饲喂WT小鼠的分析。(A)VEGFb、(B)VEGFR1和(C)Nrp1在收集的组织中的表达。(D)肝、水中血管内皮生长因子-B信号通路的活性。(E)WAT细胞分级为脂肪细胞、内皮细胞和间质细胞的图示。(F)PECAM1、(G)、AdipoQ、(H)CCL2、(I)Vegfb、(J)VEGFR1和(K)Nrp1在分离的Wat组分中的表达。(L)VEGF-B、FABP4和(M)VEGFR-1、IB4、NRP-1免疫标记图像。图表中描绘了动物的数量。数据以均值±结构方程(单因素方差，后跟Tukey‘s或Dunnett)表示。S多重比较检验)。小写字母表示事后分析的显着性(p<0.05)，不同字母的组在每次事后比较中具有统计学差异。EWAT，附睾白色脂肪组织；WT，野生型。）

肝脏脂肪变性和非酒精性脂肪肝的发生受水中血管内皮生长因子-B活性的调节

为了确定WAT中的VEGF-B信号在NAFLD发生中的作用，我们建立了脂肪细胞特异性的VEGF-B过度表达(AdipoqCre/+/VEGFbtg/+)或脂肪细胞特异性的Vegfb杂合子缺失(AdipoqCre+/Vegfbfl/+)的小鼠，并用高脂饲料或饲料喂养(图S4A-D)。

对照组动物为WT/WT、WT/AdipoqCre+和WT/Vegfbfl/+，为对照组，WT/WT、WT/AdipoqCre+和WT/VEGF-BTG/+为对照组。

对eWAT中VEGF-B的表达进行了评估，结果显示，与各自的对照组相比，AdipoqCre+/VEGFbtg/+小鼠的VEGF-B水平增加了4倍，AdipoqCre+/Vegfbfl/+小鼠的水平降低了2倍(图4A-D)。

ADIPOQ-CRE驱动的小鼠品系是脂肪组织特有的，在Wat和棕色脂肪组织中都显示了重组。相应地，棕色脂肪组织的分析显示，在AdipoqCre+/VEGF-BTG/+小鼠和AdipoqCre+/Vegfbfl/+小鼠中，Vegfb的表达水平分别增加和降低，而不表达脂联素的组织中的Vegfb转录水平没有改变(图S4E-J)。

为了评估WAT中的VEGF-B活性是否与脂肪分解和NAFLD直接相关，对AdipoqCre+/VEGF-BTG/+和AdipoqCre+/Vegfbfl/+小鼠的肝脏、eWAT和血浆进行了分析。

与高脂饲料喂养的AdipoqCre+/Vegfbfl/+小鼠相比，高脂饲料喂养的AdipoqCre/+/VEGFBTG/+小鼠的肝脏脂肪变性、肝脏炎症、肝细胞球化和NAS增加(图4E-J)。

在高脂饲料喂养的脂肪细胞特异性转基因小鼠之间没有检测到纤维化评分的差异(图4K，L)。与高脂饲料喂养的AdipoqCre+/Vegfbfl/+小鼠相比，高脂饲料喂养的AdipoqCre/+/VEGFBTG/+小鼠的肝脏形态受损与血浆ALT升高有关(图4M)。

在饲料中，AdipoqCre/+/VEGFBTG/+小鼠的LD含量高于AdipoqCre+/Vegfbfl/+小鼠和对照组小鼠(图S4K，L)。

然而，在喂养脂肪细胞特异的转基因小鼠中，没有其他肝脏异常的迹象(图S4M，N)。

（图4.WAT中的血管内皮生长因子-B信号有助于NAFLD的发展。饲喂饲料和高脂饲料的小鼠AdipoqCre/+/VEGFBTG/+、AdipoqCre+/Vegfbfl/+和对照小鼠的分析。(A)AdipoqCre/+/VEGFBTG/+和(B)AdipoqCre+/Vegfbfl/+小鼠和对照组小鼠eWAT中均有Vegfb的表达。(C)AdipoqCre/+/VEGFBTG/+小鼠和(D)AdipoqCre+/Vegfbfl/+小鼠和对照组小鼠的eWAT免疫标记血管内皮生长因子-B和FABP4的图像。肝脏(E-F)脂联素和(GH)F4/80表达的图像和定量。肝脏(I-J)H&E-和(K-L)MT染色图像和组织学评分。(M)血浆ALT水平。图表中描绘了动物的数量。

数据显示为平均值±Sm(未配对的学生。先进行韦尔奇修正或单因素方差检验，再进行Tukey‘s或Dunnett检验。S多重比较检验)。

小写字母表示事后分析的显着性(p<0.05)，不同字母的组在每次事后比较中具有统计学差异。AdipoqCre/+/VEGFBTG/+，脂肪细胞特异性过表达VEGF-B；AdipoqCre+/Vegfbfl/+，脂肪细胞特异性Vegfb杂合性缺失；ALT，丙氨酸氨基转移酶；eWAT，附睾白脂肪组织；HE，苏木精-伊红；HFD，高脂饮食；MT，马松毛；NAFLD，非酒精性脂肪性肝病；NAS，非酒精性脂肪性肝病活动评分。）

WAT中的VEGF-B信号调节脂肪分解和NAFLD的发展

hfd喂养的AdipoqCre+/ vegbfl /+小鼠显示WAT脂肪分解减少，HSL活性和Adipo-IR降低，与hfd喂养的抗vegf - b- ab处理的小鼠相似(表1和图5A-D)。

相比之下，在HFD和chow中，AdipoqCre/+/VEGFBTG/+小鼠显示出更高的脂溶活性和Adipo-IR(图5A-D和图S4O-R和表S1)。

此外，脂肪细胞特异性转基因小鼠在HFD上未检测到WAT中脂溶调节基因的表达水平变化(图S4S,T)。

对脂肪组织中VEGF-B活性的操纵影响了脂质代谢和WAT脂肪分解相关基因的肝脏表达。与对照组相比，饲喂hfd的AdipoqCre/+/VEGFBTG/+小鼠的DNL增加，饲喂hfd的AdipoqCre+/ vegbfl /+小鼠的DNL减少(图S4U,V)。Fgf21在hfd喂养的AdipoqCre/+/VEGFBTG/+小鼠中表达升高，而在hfd喂养的AdipoqCre+/ vegbfl /+小鼠中表达降低(图S4W,X)。hfd喂养的AdipoqCre/+/ VEGFBTG/+小鼠也显示出Ppargc1a水平升高，而hfd喂养的AdipoqCre+/ vegbfl /+小鼠没有检测到差异(图4W,X)。

ppara介导的b-氧化或脂解调节因子的肝脏组分表达没有改变(图S4Y-AB)。

脂肪处理VEGF-B活性影响脂肪细胞的大小，因为与各自的对照组相比，在chow-和HFD中，AdipoqCre/+/VEGFBTG/+小鼠的脂肪细胞较小，而AdipoqCre+/ vegbfl /+小鼠的脂肪细胞较大(图5E-G和图S5A-C)。

在脂肪细胞特异性转基因小鼠中，脂肪组织重量没有明显差异(图S5D,E)。

与对照组相比，饲喂hfd的AdipoqCre/+/VEGFBTG/+小鼠eWAT炎症增加，饲喂hfd的AdipoqCre+/ vegbfl /+小鼠eWAT炎症减少(图5H-J和图S5F-I)。在低饮食组，WAT过表达VEGF-B足以诱导轻度eWAT炎症(图S5J)。

在T2DM中，功能失调的WAT与病理性血管生成有关。通过测量CD31在脂肪细胞特异性转基因小鼠中的表达来评估eWAT血管化。

与对照tg小鼠相比，AdipoqCre/+/ VEGFBTG/+小鼠的血管密度和每脂肪细胞CD31表达比均增加(图5K-P和S5K-N)。

然而，与对照组小鼠相比，AdipoqCre+/ vegbfl /+小鼠的血管密度没有差异(图5N-P和S5O-R)。全贴装染色和CD31表达测量以及3D成像证实AdipoqCre+/ VEGF-BTG/+小鼠eWAT血管扩张，而AdipoqCre+/ vegbfl /+小鼠血管网络相似(电影1A-D)。

hfd喂养的小鼠中VEGF-B的过度表达被认为可以通过增加血管密度和激活WAT中的产热程序来改善肝脏脂肪变性。

在AdipoqCre+/VEGF-BTG/+和AdipoqCre+/ vegbfl /+小鼠中，调节WAT褐变的基因表达没有改变(图5s - t)。

总体而言，脂肪调节VEGF-B表达对体重、血浆胰岛素或葡萄糖水平、HOMA-IR或全身葡萄糖或胰岛素耐量没有影响(表1、表S1和图S5U-AJ)。

（图5.血管内皮生长因子-B通过控制脂肪分解调节非酒精性脂肪性肝病的发展。高脂饲料喂养小鼠AdipoqCre/+/VEGFBTG/+、AdipoqCre+/Vegfbfl/+及对照小鼠的分析。

(A)WAT体外脂解和(B)血浆NEFA水平。(C)图像和(D)水中p-HSL的量化。(E)H&E染色；(F)脂肪细胞大小定量；(G)脂肪细胞大小分布。(H)CLS密度和(I-J)促炎基因表达。(K，N)图像和(L，O)WAT中CD31表达的定量和(M，P)每脂肪细胞CD31表达的定量。图表中描绘了动物的数量。数据显示为平均值±Sm(未配对的学生。带韦尔奇修正或单因素方差的t检验，后跟Tukey‘s或Dunnett检验。S多重比较检验)。小写字母表示事后分析的显着性(p<0.05)，不同字母的组在每次事后比较中具有统计学差异。AdipoqCre/+/VEGFBTG/+，脂肪细胞特异性过表达血管内皮生长因子-B；AdipoqCre+/Vegfbfl/+，脂肪细胞特异性Vegfb杂合性缺失。CLS，冠状结构；ECs，内皮细胞；eWAT，附睾白色脂肪组织；HE，苏木精-伊红；HFD，高脂饮食；NAFLD，非酒精性脂肪性肝病；NEFA，非酯化脂肪酸。）

人非酒精性脂肪肝WAT中血管内皮生长因子-B信号的激活

为了评估血管内皮生长因子-B信号在人类NAFLD患者中的作用，我们分析了48名接受减肥手术的肥胖女性的临床队列。10在这项临床研究中，与非NAFLD患者相比，NAFLD患者的SAT中VEGFB上调了38%。用免疫组织化学方法检测不同WAT中VEGF-B的表达，结果显示NAFLD患者的SAT和VAT中VEGF-B的表达增加(图6A，B和图S6A、B)。

（图6.WAT中的血管内皮生长因子-B信号与人类NAFLD的发展有关。来自现有临床队列的肥胖妇女的分析，有或没有NAFLD。(A)SAT人体组织切片中血管内皮生长因子-B和FABP4的免疫标记图像。(B)血管内皮生长因子-B、endoglin和CD45在SAT人体组织切片中的免疫标记图像。Wat VEGFB表达与(C)血浆ALT、(D)血浆AST、(E)血浆GGT和(F)NAFLD严重程度之间的关联图。

数据显示为单独的XY对。统计分析采用简单线性回归分析，p<0.05被认为是显著的，并显示了皮尔逊相关系数(P)。ALT，丙氨酸氨基转移酶；AST，天冬氨酸转氨酶；GGT，γ-谷氨酰转移酶；NAFLD，非酒精性脂肪性肝病；SAT，皮下白色脂肪组织；WAT，白色脂肪组织）

VEGF-B主要表达于脂肪细胞，且与FABP4标记密切相关，而在内皮细胞和炎性细胞中均有少量表达。

当分析SAT和VAT转录本时，VEGFB的表达与脂肪分解、FA摄取、DNL、炎症和纤维化的基因标记物呈正相关(表S2)

Sat VEGFB水平与VEGF、VEGFR1和VEGFR2的表达呈正相关(表S2)。

为了评估WAT中VEGFB信号的激活是否与NAFLD的发展相关，我们比较了SAT和VAT中VEGFB的水平与肝功能、患者血浆参数和NAFLD严重程度的关系。

VEGFB表达与肝功能下降和NAFLD严重程度呈正相关(图6C-F)。

血管内皮生长因子-B与NAFLD发生的相关性是由于血管内皮生长因子-B配体的特异性，因为未检测到血管内皮生长因子水平与肝功能障碍之间的相关性(图S6C-F)。

我们的数据表明，VEGF-B拮抗剂通过靶向Wat中的脂解活性，是对抗人类NAFLD的一个有吸引力的靶点。

讨论

越来越多的证据表明，T2 DM所致的WAT功能障碍与NAFLD的发生发展密切相关。

在这里，我们证明了脂肪细胞中的血管内皮生长因子-B信号控制脂肪分解，结果是肝脏对FAs的摄取增加，导致糖尿病小鼠和人类的肝脏狭窄和NAFLD进展(图7)。

在NAFLD中，肝脏DNL增加和Wat脂解是导致肝脏脂质积聚的主要原因。13 Wat中的VEGF-B信号在一定程度上影响了肝脏DNL的活性；然而，通过阻断抗VEGF-B而改善NAFLD表型的主要机制是由于Wat脂解减少所致。从机制上讲，我们证明了脂肪细胞中的血管内皮生长因子-B活性通过靶向胰岛素抵抗和HSL活性来控制肝脏脂肪变性。抑制血管内皮生长因子-B可通过多种途径靶向HSL活性。WAT是高度血管化的，血管内皮生长因子-B受体在WAT血管系统中表达。

因此，血管内皮生长因子-B可能通过脂肪组织库和内皮细胞之间的相互信号来调节脂解和HSL活性。脂肪细胞和内皮细胞中的脂解机制之间的联系目前还不清楚。

另一种可能性是，VEGF-B信号通过靶向Wat炎症来间接控制HSL的活性。在2型糖尿病和肥胖症中，WAT炎症通过激活PDE3B产生儿茶酚胺抵抗，PDE3B通过去磷酸化使HSL失活。

由于eWAT中的VEGF-B活性被证明可以控制高脂饮食喂养的小鼠的炎症，因此有可能也可以通过VEGFB拮抗来解决儿茶酚胺抵抗。

我们的数据显示，NAFLD的发生是通过激活WAT中的VEGF-B信号进行的，而不是在肝脏中。

在WAT中，VEGF-B信号的主要受体VEGFR1在内皮细胞中强烈表达，但也在巨噬细胞和单核细胞中检测到。

靶向VEGFR1-巨噬细胞轴已被证明在癌症、关节炎和动脉粥样硬化的动物模型中减少炎症和疾病进展。

为了解决VEGFR1-巨噬细胞轴在Wat功能障碍和肝脏脂肪变性中的作用，Seki等人脂肪细胞特异性转基因小鼠的代谢特征表明，只有内皮细胞中VEGFR1的缺失才能缓解T2 DM和肝脏脂肪变性。

因此，在T2 DM中，ECs上VEGFR1的激活增加可能会触发炎症细胞向WAT募集，而抑制VEGFR1EC轴可被视为T2 DM的一个特异性靶点。

结合这些研究，我们的数据表明，血管内皮生长因子-B缺乏针对WAT中VEGFR1-EC轴，并可能是减轻炎症的潜在机制。

在肥胖中，病理性血管形成与脂肪组织功能障碍和代谢性疾病的风险相关。

我们的数据以及其他人的数据表明，在WAT中过表达VEGF-B通过将VEGF-A结合从VEGFR1信号转移到VEGFR2信号和随后的血管生成而增加了血管形成。

然而，在饮食和高脂饲料喂养的小鼠的WAT中没有观察到强烈的血管表型，脂肪细胞中的VEGF-B活性降低。

这并不令人惊讶， 因为在正常情况下，甚至在除心脏外的大多数组织中过表达时，血管内皮生长因子-B都不直接参与血管生成 。

在一项临床研究中，Oscar等人发现VEGFB是患有NAFLD的女性SAT中独特的NAFLD特征的一部分(10)。

我们对上述研究中收集的临床参与者的SAT和VAT活检组织的进一步分析表明，VEGF-B主要在脂肪细胞中表达，并且VEGFB的表达与WAT功能障碍、肝损伤和NAFLD严重程度相关。

在对NAFLD患者的另一项临床研究中，发现血浆VEGF-B水平非酒精性脂肪肝患者(84例)显著高于非酒精性脂肪肝患者(110例)。

多元线性回归分析显示，丙氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶与血浆血管内皮生长因子-B水平独立相关。

综合分析以往发表的NAFLD患者的临床数据，结合我们的数据分析，VEGFB信号可能在人类NAFLD的病理生理学中发挥重要作用，并代表一个有潜力的治疗靶点 。

（图7。 血管内皮生长因子-B调节脂肪分解和非酒精性脂肪肝发生的假想模型 。

在T2DM和NAFLD中，WAT对胰岛素的抗脂作用产生抵抗，随后脂肪细胞的脂解作用增加。这会导致FFAs释放到血液中的增加，增加肝脏脂肪堆积，并导致脂毒性和NAFLD的发展。 假说是，阻断血管内皮生长因子-B信号可以通过减少脂肪细胞中的脂肪分解和HSL的活性来改善NAFLD的发展 。HSL是脂肪细胞中的一种脂肪分解调节酶，可以解决Wat胰岛素抵抗。

游离脂肪酸；NAFLD，非酒精性脂肪肝；T2 DM，2型糖尿病；WAT，白色脂肪组织。）